PCR實驗室在操作時應(yīng)注意事項

  PCR檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導(dǎo)致各種問題，因此，進行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染出現(xiàn)。

 

　　(1)劃分操作區(qū)：

 

　　目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：

 

　?、贅吮咎幚韰^(qū)，包括：擴增摸板制備;

 

　　②PCR擴增區(qū)，包括：反應(yīng)液的配制和PCR擴增;

 

　?、郛a(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。

 

　　※各工作區(qū)要具有一定隔離，操作器材專用，要有一定方向性，如，標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

 

　　切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

 

　　(2)分裝試劑：

 

　　PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝，所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源DNA：

 

　　①PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;

 

　?、谝锖蚫-NTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制;

 

　?、垡锖蚫-NTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因;

 

　　(3)實驗操作注意事項：

 

　　盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。

 

　　因此：不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

 

　?、俅饕淮涡允痔?，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套;

 

　?、谑褂靡淮涡晕^，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染;

 

　?、郾苊夥磻?yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

 

　?、懿僮鞫喾輼悠窌r，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度;

 

　　⑤最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管;

 

　?、薏僮鲿r設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性;

 

　?、弑M可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如，沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);

 

　?、嘀貜?fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。

 

　　PCR擴增重要標準

 

　　什么是PCR實驗靈敏度?

 

　　靈敏度指的是PCR擴增反應(yīng)能夠檢測到目的基因最小值。研究結(jié)果表明，影響PCR擴增效率的因素，如，模板的復(fù)雜程度與完整性、引物純度及其與模板結(jié)合效率、反應(yīng)溫度、DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性與擴增性能、反應(yīng)緩沖液的離子組成(主要指：陽離子)、反應(yīng)優(yōu)化劑等，均決定PCR實驗檢測靈敏度。在最佳擴增條件下，常規(guī)PCR反應(yīng)能夠檢測到pg(10～12g)數(shù)量級目的基因。對于一個特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應(yīng)體系(包括：DNA聚合酶與反應(yīng)緩沖液等)就是研究者提高PCR實驗靈敏度的關(guān)鍵因素了。

 

　　與實驗室自配PCR擴增體系相比，東盛Taq Mix對反應(yīng)緩沖液中的成分進行優(yōu)化，并加入了適當比例的反應(yīng)增強劑(PCR Enhancer)，提高DNA聚合酶熱穩(wěn)定性，顯著降低模板二級結(jié)構(gòu)對PCR擴增性能影響，使得DNA聚合酶處于最適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高檢測靈敏度。即時反應(yīng)體系中只有幾個目的基因拷貝，也能輕松檢測。

 

　　什么是PCR實驗特異性?

 

　　特異性指的是在PCR擴增過程中，專一性擴增目的片段而非其他片段的性能。在PCR實驗本身的靈敏度很高，且實驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會在目的片段出現(xiàn)同時伴隨有其他雜帶，即，發(fā)生非特異性擴增現(xiàn)象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應(yīng)條件控制等均會影響PCR擴增特異性。近年，研究結(jié)果表明，緩沖液品質(zhì)(如，離子種類與組成，反應(yīng)優(yōu)化劑等)對保證PCR特異性擴增起著不可忽視的作用。一般緩沖液中調(diào)節(jié)氫鍵作用鹽只有KCl，而東盛HSTMTaq Mix的緩沖體系通過反應(yīng)優(yōu)化劑以及KCl/(NH4)SO4鹽離子體系平衡調(diào)節(jié)，顯著提高PCR擴增特異性，降低背景。

 

　　PCR實驗靈敏度與特異性是一對此長彼消特性，這也決定我們實驗體系調(diào)節(jié)實際上就是需要找到適合實驗靈敏度與特異性平衡點。由于PCR體系中的眾多成分，使得組合較多，篩選工作繁雜。東盛基于靈敏度與特異性分別設(shè)計了PCR Mix和HS Taq Mix，幫您確定大平衡點，如果您需要更細致的平衡點，請選擇相應(yīng)的Mix Kit系列進行微調(diào)。