PCR技術(shù)的原理與方法

 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。

PCR技術(shù)的基本原理

一、PCR反應成分：

1、模板DNA；

2、引物；

3、四種脫氧核糖核苷酸；

4、DNA聚合酶；

5、反應緩沖液、Mg2+等。

二、PCR反應基本步驟：

1、變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程，高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。

2、退火(annealling)：當溫度降低時，引物與模板DNA中互補區(qū)域結(jié)合成雜交分子，低溫下，引物與模板DNA互補區(qū)結(jié)合（55℃，30s）。

3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈，中溫延伸，DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應（70～72℃，30～60s） 

以上述三個步驟為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。

 

PCR擴增的基本方法

 

PCR反應的成分和作用

總體積：一般為25μl～100μl

一、無Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過50?mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對應dNTP為200?μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟爭Mg2+，當dNTP濃度達到1?mmol/L時會抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影響反應的特異性和產(chǎn)率。、

三、BSA：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護作用。

四、底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲濃度為 10 mmol/L，各成份以等當量配制，反應終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低。

五、Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5～5個單位/100μl。

六、模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。

七、引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般15～30個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物G+C約占45～55%，堿基應盡量隨機分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應有互補鏈存在，不能與非目的擴增區(qū)有同源性。

PCR反應條件的選擇（影響因素）

溫度參數(shù)：

1、變性：模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。

2、退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在15～25bp可通過公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃計算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時間為30～45s。如果(G+C)低于50%，退火溫度應低于55℃。較高的退火溫度可提高反應的特異性。

3、延伸：延伸溫度應在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。延伸時間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定，通常對于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。

循環(huán)數(shù)：

PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預試驗確定。

PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：