DNA測序技術(shù)不同的發(fā)展階段的特點

 人類基因組計劃、基因芯片、個性化分子診斷、生物云計算……這些在21世紀第一個十年里吸引無數(shù)眼球的熱門詞匯，都和一個產(chǎn)業(yè)頗有淵源——DNA測序。生物技術(shù)和信息技術(shù)在這片創(chuàng)意新天地里水乳交融，如果用一句詩來形容坐擁兩大技術(shù)護航的DNA測序產(chǎn)業(yè)，那就是——天生麗質(zhì)難自棄。

 

隨著人類基因組計劃的完成，人類對自身遺傳信息的了解和掌握有了前所未有的進步。與此同時，分子水平的基因檢測技術(shù)平臺不斷發(fā)展和完善，使得基因檢測技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，基因檢測效率不斷提高。從最初第一代以 Sanger 測序為代表的直接檢測技術(shù)和以連鎖分析為代表的間接測序技術(shù)，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標志的新一代測 序 (next-generation sequencing，NGS) 的 相 繼 出現(xiàn)，測序效率明顯提升，時間明顯縮短，費用明顯降低，基因檢測手段有了革命性的變化。

 

DNA測序技術(shù)經(jīng)歷了不同的發(fā)展階段，本文將全面介紹第一代、第二代、第三代測序的基本原理、代表性的測序平臺以及不同發(fā)展階段的測序技術(shù)的特點。

 

 

 

第一代測序技術(shù)

 

 

傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法、化學降解法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術(shù)。人類基因組計劃(human genome project，HGP)主要基于第一代DNA測序技術(shù)。最常用的第一代測序技術(shù)是雙脫氧鏈終止法，通常稱為Sanger法。

 

 

 

 

雙脫氧鏈終止法

 

 

 

雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法。該方法的原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸(dNTP，其中的一種用放射性P32標記)存在條件下復制時，在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，因為雙脫氧核苷沒有3’OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端，該鏈就停止延長，若鏈端摻入單脫氧核苷，鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分4個泳道進行凝膠電泳，分離長短不一的核酸片段，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后，根據(jù)片段3’端的雙脫氧核苷酸，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。

 

 

 

 

第一代測序技術(shù)的特點

 

第一代測序技術(shù)的主要特點是：

• 準確性高達99.999%；

• 測序成本高；

• 通量低。

 

第二代測序技術(shù)（NGS）

隨著人類基因組計劃的完成，人們進入了后基因組時代，即功能基因組時代，傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測序和重復測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求，這促使了新一代DNA測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)也稱為第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLID測序平臺。

 

第二代測序技術(shù)核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列。以Illumina的技術(shù)原理為例做一下說明：先在片段DNA兩端連上接頭，目的是能夠匹配到芯片上的接頭，接著與芯片雜交，進行橋式擴增，接著簇的形成，是為了保證信號強度，再加入四種有阻滯劑和熒光標記的單核苷酸，如此循環(huán)，記錄每個循環(huán)的熒光信息，最后得到序列信息。

 

 

第二代測序技術(shù)的特點

 

第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量，一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行，同時成本也大大下降。